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A1: 目前培养的类器官主要来源于上皮细胞，对于非上皮细胞来源的类器官培养方式还需要进一步研究。

A2: 常见的类器官根据起始细胞的类型，可以分为两种：

（1）肿瘤组织来源的肿瘤类器官；

（2）干细胞来源的类器官，包括：多能性干细胞 (PSC) /成体干细胞 (ASC)以及诱导多能干细胞(iPSC)。

A3: 类器官并不是单一细胞组成的结构，而是由具有干细胞性质的起始细胞进行分裂和分化，并将多种类型的细胞自组装的结构，自组装后的形态和功能与体内相应器官相似。

A4：可以的。已有学者验证过，将人结肠癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌和肝癌的手术组织切碎后，以梯度降温的方式进行冷冻，最终在液氮中保存15-18个月后进行复苏和原代细胞提取，分别对细胞进行2D和3D培养，证实了冻存对于细胞活力和生长速度均无显著影响^【1】。

当然，由于组织来源不同、冻存条件不同，还需要大家根据实际情况进行验证，新鲜组织提取的细胞依然是3D培养的最佳选择。

A5：类器官可以冻存，通常会在传代2-3次之后选择冻存。为了达到最佳的效果，可以选择类器官成熟（传代7-10次）后再进行冻存。

A6：是的，主要的原因是类器官内部缺乏循环系统。

当类器官的尺寸较大时，靠近中心的细胞难以和外界进行氧气和营养成分的交换。因此这个结构尺寸越大，死亡的细胞就越多（如图1）^【2】。我们在培养的过程中，需要控制类器官的大小在4-5mm以内。未来的类器官技术可以与血管类器官结合在一起，建立一个功能性的封闭循环系统，用以培养出更大尺寸的类器官。

A7：类器官的传代通常是根据培养的时间判断。一般在7-14天时进行第一次传代，后续则每7-10天传代一次^【3】。

A8：大部分类器官可以在体外连续传代10次（>6个月），甚至有些类器官可以连续传代20次（>12个月）并且维持原有的生长速度^【4】。

A9: 初步可以通过显微镜和H&E染色观察形态；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术检测该类器官是否表达相应的biomarker；基因测序可以鉴定所培养的类器官是否有某些特征丢失；对于部分类器官，还可以检测其是否具有功能，例如：已有研究检测出胃类器官可以分泌胃酸，心脏类器官可以自主跳动。

A10: 在进行类器官培养前，我们需要了解该器官在体内的发育过程，及早期发育相关的信号通路。

以胃类器官培养为例：胃由前后肠发育而来，早期发育需要由多种信号通路共同调控。那么在体外我们需要通过添加细胞因子的方式，指导激活/抑制相应的信号通路，来达到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化为内胚层，Wnt3a、FGF-4和Noggin指导细胞向向前肠分化^【5】。

A1: 类器官是由不同类型的细胞组成的结构，并且在体外是自组装的，因此很容易存在同一样本在相同培养条件下的孔间差异。

如果是用于患者个性化医疗的肿瘤类器官，需要更精准地模拟患者体内的特征，这种情况建议采用多个平行来减小差异；

如果是用于机制研究或用作疾病模型的类器官，可以考虑利用“微流控液滴技术”进行工程化培养，相关成果已发表在Cell Reports Medicine^【1】。

A2：已有动物实验证实过可行性，比如：肠类器官移植小鼠治疗溃疡性结肠炎^【2】；胰岛类器官移植小鼠治疗糖尿病^【3】。

虽然目前类器官移植尚未进入临床，但在2021年2月，Science^【4】首次报道了利用胆道类器官修复离体条件下的人类肝脏，实现了胆道再生，并改善了胆汁性质。

A3：这个问题可以在Nature Protocols^【5】找到答案。

对于新鲜培养的类器官：建议对低代次类器官（2-3代）进行药物筛选，以最大限度地减少使用过的培养基或体外突变累积对药物测试的影响。

对于经过冻存的类器官：由于冷冻/解冻可能导致复苏时器官样形态的变化，因此建议类器官至少传代一次再进行药物筛选。如果出现复苏后细胞活力不佳，则需要延长培养时间以恢复细胞状态。

A4：1、判断形态。显微镜下类器官形态可能为空泡状、出芽状、紧密型、松散型等，但整体形态一致。

2、可以鉴定相应的biomarker是否有表达，及分布是否与组织切片相似。

3、是否能够传代3次以上，并可以冻存复苏。

4、如果有条件的话，可以进行测序分析。

A5：可以，干细胞来源类器官的基因编辑多用于疾病建模，而肿瘤来源的类器官则多用于寻找疾病相关突变点或治疗靶点，图1列举了类器官基因编辑的部分研究和应用。

A6：1、细胞来源有区别：类器官的细胞来源是具有多能性的上皮细胞，而普通细胞培养适用于培养多种类型细胞；

2、 细胞培养方式不同：1）类器官需要基质胶等材料支撑其三维结构，普通细胞培养则不需要；2） 类器官需要实现体外分化和自组装，因此需要多种细胞因子的组合进行诱导，培养基成分复杂。而普通细胞培养通常为单一种类细胞，因此培养基成分较简单；

A7：通常来讲，如果肿瘤发生了转移，我们依然选用相对应的原发灶（A类型）PDO培养基。

A8：类器官的分化方式本质上是在模拟体内的器官发育，因此表达形态及各细胞分布情况与实际器官具有相似性，而细胞团则没有这种规律。我们可以通过免疫荧光的方式检测biomarkers的分布情况来区分。例如下图中的结果表明，肾类器官与肾组织的biomarkers分布高度一致^【7】。

A9：由于类器官涉及到体外分化和自组装，因此来源细胞必须具有多能性。正常组织的成熟体细胞中往往会有一部分成体干细胞（标志物为Lgr5，CD133等），这部分细胞也可以进行类器官培养。

A10：依据Hans Clevers实验室早期发表的文章，可以采用条件性培养基代替纯化的细胞因子进行类器官培养，但同时也需要考虑条件性培养基的不足之处。小编总结了条件性培养基和近岸细胞因子的参数差异。

A2：考虑到DMSO这类有机物的细胞毒性，建议终浓度不超过0.1%（v/v）。

A3：黑色小颗粒大概率是杂质或细胞碎片，去除它们有以下两种方式可以参考：

1、将类器官消化下来，用培养基进行反复清洗，达到稀释杂质的作用；

2、用无菌手术刀将类器官切成两半，取1ml注射器吸满培养基并轻轻推出，冲洗类器官中的杂质^【2】。

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的优势，通常有以下两种结合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性价比更高的方式，即：先利用PDO进行高通量的药物筛选，筛选出有效的药物再进行PDX测试。

2、PDX-PDXO是更精准的药物测试方式，即：先利用PDX产生大量的体内肿瘤，然后将这些肿瘤分离进行PDXO培养，此时可以通过PDX模型，将PDXO的药敏实验结果与体内用药结果一一对应，进而预测人体用药的结果，实现对患者更精准的用药指导；并且可以用PDX模型将转移后的肿瘤分离，同样进行PDXO培养和用药，能够更精确地对转移灶进行药物筛选。

A5：1、将类器官放置在冰上，待基质胶融化后离心进行回收，这种方式适用于不需要将类器官结构完全打散的情况；

2、市售的细胞回收液，可以温和有效地获得细胞悬液，不会损伤细胞或细胞表面蛋白。

A6：基质胶能够为类器官提供支撑作用，目前类器官培养用的基质胶来源于小鼠肉瘤的基底膜基质，其中含有约60%层粘连蛋白、30% IV 胶原和8%的巢蛋白，还含有基底膜聚糖、TGF-ß、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原等1800多种独特的蛋白质。由于基质胶中各因子的不确定性，并且存在批次间差异，因此目前也有一些聚焦于基质胶替代方案的研究，如图2^【3】。

A7：1、根据所模拟的器官自身生长情况选择，例如：皮肤的正常生长是有一面需要接触空气，那么对于皮肤类器官的培养倾向于利用气-液交互法来培养^【4】；

2、考虑所培养的类器官模型的应用方向，例如：气-液交互法培养易于进行病毒感染实验，因此用于病毒感染实验的气道类器官会优先选择气-液交互法培养^【5】。

A8：药物筛选前，通常将类器官吹散后，用含2%-5%基质胶的培养基悬浮，并最终铺在基质胶包被的孔板中^【6-7】。

A9：建议采用水平转子代替角转子，可以有效减少类器官挂在离心管壁的情况。

A10：1、抗体药物因为需要免疫细胞的参与，因此肿瘤类器官不能筛选抗体类药物，此类药物筛选需要构建肿瘤类器官-肿瘤微环境的模型来实现；

2、由于肿瘤类器官中没有对血管进行培养，因此抗血管类的药物也同样不能进行筛选。